{科研}IKK抑制RIPK1介导的细胞死亡效应机制研究

Tnf作用于细胞膜上的受体tnfr1，引发一系列细胞内信号转导过程，从而引起炎症反应或细胞死亡。转录因子nf-kb在肿瘤坏死因子信号通路中起着不可或缺的作用。正是nf-kb的激活导致一系列下游基因的表达，使细胞进入炎症状态。在nf-kb的上游，有一种叫做ikk的蛋白激酶复合体，由ikkα、ikkβ和ikkγ三个蛋白亚基组成。其中，ikkγ对ikk复合体的活性起调节作用。

tnfr1的激活会形成同三聚体复合物，并能吸引下游蛋白(tradd，ripk1，traf2，ciap1/2)形成蛋白复合物。ciap1/2是e3泛素连接酶，可以泛素化ripk1的特定位点，泛素化后的ripk1可以进一步募集nemo(ikkγ)并使其泛素化。此外，泛素化的ripk1还可以募集tab2/3和下游激酶tak1，最终磷酸化并激活ikk，导致信号释放。Nf-kb可以促进一些抗凋亡基因的表达，如c-flip，从而抑制tnfr1信号本身引起的凋亡效应。

目前已知的ripk1引起的细胞死亡主要包括fadd-caspase8复合物介导的细胞凋亡和ripk3-mlkl复合物介导的细胞坏死。虽然我们知道ripk1的泛素化首先是由ciap引起的，但ripk1激活后如何调节细胞死亡的分子机制目前尚不清楚。为了解决这个问题，比利时mathieu j.m. bertrand的研究小组进行了相关研究，研究结果发表在最新一期的《分子细胞》杂志上。

作者首先以nemo-//-wt小鼠胚胎成纤维细胞(mef)为研究对象，分别用tnf-a/tnf-a+nec1(一种ripk1抑制剂)/对照进行处理，比较其细胞死亡情况。结果表明，与野生型细胞相比，nemo敲除细胞对tnf-a有明显的凋亡刺激作用，表明nemo可以保护细胞免受TNF-a的杀伤作用。

此外，作者发现在tnf-a和nec-1的联合刺激下，细胞死亡的程度显著降低，这表明tnf-a引起的细胞死亡与ripk1有关。由于nemo的主要功能是调节ikkα和ikkβ的活性，作者推测这两个亚单位是否也参与了这一调节过程。之后作者又以ikkα-/-和ikkβ-/-mef为对象进行了同样的刺激实验，结果表明单独敲除任何一个亚单位对tnf-a刺激的致死作用都不够明显。作者比较了ikkα-/- ikkβ-/-的mef，得到了与nemo-/-相似的实验结果。这些结果表明ikkα和ikkβ可以抑制ripk1介导的细胞凋亡。

由于ikkα和ikkβ是丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶，作者推测这种保护是否依赖于它们的激酶活性。因此，作者用不同类型的ikk酶活性抑制剂治疗，并如上所述刺激它们。结果表明，在肿瘤坏死因子α的刺激下，药物处理的细胞表现出类似ikk敲除的致死效应，这一结果表明ikk的保护作用依赖于其激酶活性。因此，作者想知道ikk的这种作用是否依赖于IKK下游nf-kb的活性。放线菌预处理抑制nf-kb下游基因的表达，实验结果与上述结果无明显差异。这一结果证实了ikk的作用与nf-kb的活性无关。

那么ikk如何影响ripk1诱导的细胞死亡事件呢？在之前的研究中，我们知道ikk和ripk1之间存在物理相互作用。结合ikk的激酶特性，作者怀疑ikk可能磷酸化ripk1并抑制ripk介导的死亡信号。作者通过生化实验发现，ripk1在野生状态下被磷酸化，由于其泛素化程度较高，难以检测。然而，在nec-1抑制ripk1本身的激酶活性后，这种磷酸化并没有消失，表明ripk1的磷酸化不是由自身磷酸化引起的。作者发现，在ikk活性受损的情况下，ripk1的磷酸化也受到影响。这些结果表明ripk1的磷酸化是由ikk催化引起的。然后，作者通过一系列的蛋白质相互作用实验，证实了ripk1磷酸化后不能与fadd-caspase8形成稳定的复合物，因此很难介导凋亡。

最后，作者还通过小鼠实验证明了ikk的活性直接影响ripk1介导的细胞死亡事件，并且这种影响不依赖于ikk下游nf-kb的活性。